沉淀技术教学课件PPT 77页

'1第三章沉淀技术 2概述沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合物而沉积的过程。沉淀VS结晶，本质上同一种过程。同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶；以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。一.沉淀的定义 3二.沉淀的类型：晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.1~1μm之间。在沉淀内部，离子按晶体结构有规则地进行排列，因而结构紧密，整个沉淀所占的体积较小，极易沉降于容器底部。无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02μm以下。沉淀内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量水分子，因而结构疏松，体积庞大，难以沉降。凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径大约为0.02~1μm，因此其性质也介于二者之间。 4设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝聚）；有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来）；沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人体的残留毒害。三.沉淀技术的应用特点 5四.沉淀方法的分类盐析法有机溶剂沉淀选择性变性沉淀等电点沉淀有机聚合物沉淀 第一节盐析法盐析：一般指溶液中加入无机盐类使某种物质溶解度降低而析出的过程。蛋白质盐析—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响6 7一、基本原理蛋白质溶解：相似者相溶亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占比例等。如白蛋白。不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占比例等。如纤维蛋白原。 8蛋白质溶液稳定的原因：1.自身带同种电荷，2.水化膜自身带同种电荷： 水化膜：蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化膜，包围于蛋白质分子周围形成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。9 1.盐溶和盐析当向蛋白质溶液中加入电解质时，蛋白质的溶解度首先将随电解质的增加而增大，这种现象称为盐溶；当继续加入电解质时，蛋白质的溶解度减小，发生聚集而沉淀，这种现象称为盐析。10 11盐溶原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白质与水分子的相互作用却加强，溶解性增大。 12盐析（1）、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了自由水，使水分子在盐离子表面聚集→蛋白质胶体外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏→蛋白质胶体表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚集，沉淀； 13（2）、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 盐析机理归纳1）.盐离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋白质表面的水化膜；2）.盐离子电荷的中和作用；3）.盐离子引起了原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。注：水活度：水分含量的活性部分或自由水。14 152、盐析公式及讨论蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：lgS=β-KsIS，蛋白质溶解度（g/L）I，离子强度=(1/2)∑cizi2ci为i离子的摩尔浓度，zi为i离子所带的电荷数。β为常数，I=0时的lgSKs为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关，Ks越大，盐析效果越好（S越小，越易沉淀） 16讨论1）、KsI项Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性质和盐的种类。盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。lgS=β-ksI 172）、β值的特性及对盐析的影响表示不外加盐时的理想溶解度S，与盐的种类无关，但与温度、pH有关；pH的影响：pI时蛋白质溶解度最低，β在pI时最小（调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化）温度的影响：高离子强度溶液中，温度升高一般使β下降（温度升高利于盐的溶解，夺取更多的水分子，使蛋白质溶解性更差）lgS=β-ksI 183）、盐析分类ks盐析：固定蛋白质的pH、T（β）,变动离子强度I达到沉淀的目的。β盐析：在一定的离子强度下（I），改变溶液的pH、T，达到沉淀的目。ks盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。lgS=β-ksI 193、无机盐的挑选原则相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白质的盐析效果不同；高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；溶解度受温度的影响小；盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；此外，还要考虑：不易引起蛋白质的变性；价格低廉；是否有毒性。 （1）相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白质的盐析效果不同；例：不同种类盐对一氧化碳血红蛋白影响不同（p26图3-4）所以选用盐的时候要考虑的不同盐的盐析效果，常见阴离子的盐析效果：PO43->SO42->CH3COO->Cl->NO3->ClO4->I->SCN–常见阴离子的盐析效果：NH4+>K+>Na+>Mg+20 （2）高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；离子强度的升高，可以降低加速盐析的过程，所以要求盐析用盐能够配制高离子强度的盐溶液。lgS=β-ksI常用盐析剂在水中的溶解度：P26表3-121 （3）溶解度受温度的影响小许多蛋白质需要在较低的温度下分离，高温下蛋白质容易失活，这就要求所选用的盐析盐必须在较低的温度下也有较高的溶解度。（P26表3-1）22 （4）盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离过高的盐溶液密度能够干扰蛋白质的沉降和沉淀物的收集，并且沉淀下来的目的产物中可能混有大量的盐，不利于目的产物的回收。23 241.最常用(NH4)2SO4，优点：（1）溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。硫铵在0℃时的溶解度70.6g/100mL，Na2SO4-4.9,NaH2PO4-1.6(p26表3-1)4、常用的几种盐 25（2）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。缺点：硫酸铵腐蚀性比较强，后期处理困难，残留在食品中会影响食品的风味；临床治疗中具有毒性，在最终产品中必须完全除去。 2.次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。26 275、盐析的影响因素盐饱和度和离子类型1）不同的蛋白质盐析，要求的盐饱和度不同。例如：硫酸铵盐分离血浆中蛋白质，饱和度达到20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至28%-33%优球蛋白析出，33%-50%，拟球蛋白析出，大于50%，白蛋白析出。2）离子种类对蛋白质溶解度也有一定的影响，通常离子半径小而带高电荷的离子的影响较强，半径大而带低电荷的离子影响较弱。 蛋白质的浓度高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25mg/mL～30mg/mL。28 29pH值对盐析的影响在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近，提高盐析效率。 30温度的影响对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。 316、盐析的操作与应用盐析的操作方法过程加入沉淀剂——沉淀物的陈化——离心过滤收集沉淀物加入沉淀剂：加入盐析盐的过程沉淀物的陈化：聚集产生沉淀的过程离心过滤收集沉淀物：收集析出沉淀的过程下面以硫酸铵盐析法为例介绍盐析法操作过程。 32硫酸铵盐使用前处理重金属离子对蛋白质巯基有敏感作用，硫酸铵中常含有少量重金属离子，所以要进行预处理。硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。1）加入沉淀剂优级纯≥99.8%分析纯≥99.7%化学纯≥99.5% 33加盐的方法（1）.固体硫酸铵加入法（需要量大时）。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。特定温度下，各种不同饱和度应加入的硫酸铵的量可以从下表查出。 3425℃调整硫酸铵饱和度查询表 352）.加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。取过量硫酸铵加热溶解，在0℃或室温放置，直至固体析出，得到饱和溶液，饱和度调整计算公式V=V0(S2—S1)/(1—S2)V为应加入饱和硫酸铵溶液的体积，V0是蛋白质溶液的原始体积，S2是所要达到的硫酸铵饱和度，S1原来溶液的硫酸铵饱和度。 36饱和溶液加入法是指将预先调好pH的饱和硫酸铵溶液逐步加至相应的蛋白质溶液中，使其达到一定的硫酸铵浓度（或饱和度），令蛋白质沉淀下来。适用范围：适用于饱和度不高，原来溶液体积不大的情况，如果加入饱和溶液后，体积过大，应改用固体加入法为好。注意：加入饱和溶液时，应边搅拌边少量分批缓慢加入，防止局部浓度过高，影响分离效果。 373）.透析平衡法将要盐析的样品置于透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶液中透析，透析袋中硫酸铵饱和度逐步提高，达到一定饱和度后，目的蛋白质析出，停止透析。特点：硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，但手续繁琐，要不断测量饱和度，所以多用于结晶。 （2）沉淀物的陈化38高分子溶液在防止过程中自发的聚集而沉淀的现象称为陈化现象。为了提高盐析的效率，盐析后一般需放置0.5-1h，待沉淀完全后才可以过滤离心，过早的分离将影响收率。 39（3）离心或过滤，收集沉淀物对于高浓度的硫酸铵溶液一般采用过滤的方法，因为离心要较高的转速的时间。对于低浓度的硫酸铵溶液则多采用离心的方法。 407、盐析后处理工作——脱盐由于盐析沉淀产物中含盐量较高，所以通过盐析法得到蛋白质后需要经过脱盐处理。脱盐最常用的方法：透析法。原理：大分子不能透过半透膜，小分子例如无机盐、单糖，可以透过膜扩散到水或缓冲液中。所以采用半透膜作为透析膜，逐步更换低盐缓冲液可以达到脱盐效果。 透析over41 42第二节有机溶剂沉淀法有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一，常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。 43（1）静电作用降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，带电的蛋白质溶质分子之间相互作用增强，使其相互吸引而聚集，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。1、原理介电常数表征的是电介质的束缚电荷的能力，极性越大，介电常数越大。 44（2）脱水作用由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。较静电作用占更主要的地位。 2、有机溶剂的选择1.能够与水互溶；2.极性应该比较小，这样才能有效降低溶液的极性；3.致变性作用要小，保护目标产物的活性；4.毒性要小挥发适中。45 46使用较多的有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮。乙醇常用于核酸、糖、氨基酸等物质的沉淀；乙醇、甲醇、丙酮常用于蛋白质、酶等物质的沉淀。由于甲醇、丙酮对人体有一定的毒性，限制了有机溶剂法的适用范围，所以不如盐析法使用普遍。 进行沉淀操作，要使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积计算：V=V0(S2—S1)/(100—S2)V为需加入100%浓度有机溶剂的体积，V0是原溶液体积，S2是所要达到的有机溶剂的浓度，S1原来溶液的有机溶剂的浓度。100指加入有机溶剂的浓度为100%，若加入的有机溶剂浓度为95%，则上式中100应换为95。47 483、影响有机溶剂沉析的因素（一）温度多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高（P33图3-9）。 49（二）样品浓度样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用，使杂蛋白也沉降下来，分离效果差。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2%（5~20mg/mL）为好，多糖则以1～2％起始较合适。 50（三）pH值选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，等电点附近沉淀易于生成，需要的有机溶剂量比较少，从而提高此沉淀法的分辨能力。 51（四）离子强度少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度达到一定量会增加蛋白质在水中的溶解度，会增加有机溶剂的用量，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5%为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜。 52（五）多价阳离子对有机溶剂沉淀的影响有些蛋白质能和多价阳离子（如Zn2+、Cu2+）结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低，并且不影响蛋白质的生物活性，这对在高浓度的溶剂中才能沉淀的特别有益，被称为助沉淀剂。 533、有机溶剂沉淀法的操作过程有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离。操作时首先选择合适的有机溶剂，然后调整样品的浓度、温度、pH、离子强度，使之达到最佳分离效果。注意：沉淀所得到的固体样品如果不是立即溶解进行下一步的分离，应该尽可能的抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如果必要可以采用透析袋析脱有机溶剂，防止影响样品的生物活性。 544、有机溶剂沉淀法的应用（一）有机溶剂沉析的特点优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易。缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 55（二）实例醇沉淀法获得多糖原料——粉碎——脱脂——粗提——吸虑或离心——沉淀——洗涤——干燥 一、选择性变性沉淀原理:是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，而有选择地使之变性沉析，以达到目的物与杂蛋白分离的技术，称为选择变性沉淀。1、热变性2、选择性酸碱变性3、表面活性剂和有机溶剂变性56第三节其他沉淀方法 57热变性定义在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。适用对象：热稳定性高的蛋白质 58实例酵母干粉中加入0.066mol/L磷酸氢二钠溶液，37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液，升温至55℃，保温20min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。 选择性酸碱变性59定义利用蛋白质和酶对溶液pH的稳定性不同，使杂蛋白变性沉淀。 60表面活性剂和有机溶剂变性定义不同蛋白质和酶对表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们能够使那些敏感性强的杂蛋白质变性沉淀，而目的产物仍然在溶液中。注意：此法通常在冰浴或冷室中进行，来保护目的物的生物活性。 61二、等电点沉淀法1、原理调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质在其净电荷为零时的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。 622.特点优点：等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法。缺点：由于许多蛋白的等电点十分接近，而且亲水性很强的蛋白质在水中溶解度较大，在等电点时也不易产生沉淀，所以单独采用此方法分辨率较低，效果不理想。 633、应用在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。 因此：如需用等电点沉淀目的产物，则需要与盐析法、有机溶剂沉淀法或者其他沉淀剂一起配合使用，来提高沉淀能力和分离效果。64由于一般蛋白质等电点多在偏酸范围内，所以等电点操作中，一般加入盐酸、磷酸、硫酸等无机酸调节pH。 653、实例①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。②工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 66③碱性磷酸酯酶（pI5.7）提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 67三、有机聚合物沉淀法定义许多水溶性非离子型聚合物，特别是聚乙二醇(PEG)可用来进行选择性沉淀用来纯化蛋白质。常用的非离子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖PEG：亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，分子量范围较广（聚合程度）。 68PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG浓度通常为20％，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。PEG对后续分离步骤，影响较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰Lowry法测定蛋白质。 原理69目前PEG使蛋白沉淀的原理经推测可能有以下几个方面：1.聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。2.由于聚合物有较强的亲水性使蛋白质脱水发生沉淀。3.聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。4.通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。但是上述推测都未得到证实。 70特点优点：操作条件温和，不容易破坏蛋白质活性；沉淀效能高，用很少的PEG可以沉淀大量的生物大分子；沉淀后有机聚合物容易除去。缺点：所得的沉淀中含有大量的PEG 影响因素711.蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量越大，在某一PEG浓度下的溶解度越小。2.蛋白质浓度蛋白质浓度越高，其间相互作用越大，所需的PEG浓度越低，但是会导致分离效果不理想，所以溶液中蛋白浓度最好低于10mg/mL。3.pHpH越接近目的物等电点，沉淀所需PEG浓度越低。 724.离子强度离子强度对部分蛋白的沉淀过程有影响。5.温度在一定范围内（0-30℃），温度对蛋白沉淀的影响不大。 73其他沉淀技术金属离子沉淀法：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀。常用的金属离子Zn2+、Ca2+、Pb2＋，例如茶多酚的提取：利用茶多酚能与Bi2+，Ca2+，Ag+等离子形成络合沉淀的原理。有机酸沉淀法：含氮有机酸如苦味酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出特点：常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。 74沉淀技术的应用1.蛋白质蛋白质（酶）的纯化在粗分离阶段常用到沉淀技术，以盐析、有机溶剂沉淀、多聚物沉淀的应用最广泛。 752.核酸核酸的高电荷磷酸骨架（3-）比蛋白质，多糖等更具亲水性PEG应用于DNA沉淀已普遍（0.01M磷酸缓冲液中PEG浓度10%）酚、氯仿抽提后（变性蛋白质），乙酸钠中和磷酸骨架负电荷（降低其亲水性，促聚集），乙醇可有效沉淀DAN（有机溶剂沉淀） 763.多糖多糖提取的初级阶段多用到乙醇沉淀或乙醇分级沉淀，选择性沉淀去除多糖中的蛋白质杂质。 思考：沉淀技术包括哪些方法？它们的原理是怎样的？77'